激光扫描细胞仪对肿瘤DNA的测定
作者：林梅绥
单位：上海第二医科大学附属第九人民医院病理科(上海 200011)
关键词：
肿瘤990517 采用细胞分析技术对各种细胞，特别是肿瘤细胞的DNA测定，已开展20余年。最初是对血细胞、脱落细胞等分散的细胞进行分析，很快发展为从新鲜实质组织，以及石蜡包埋组织中分离细胞进行DNA测定[1]。由Kamentsky最近开发的新的细胞分析仪-激光扫描细胞仪(Laser Scanning Cytometer, LSC)[2]，以多组参数分析细胞及形态，成为国外的一个注目点。本研究用改良的方法，简单快速地从石蜡包埋组织中分离细胞[3]，同时用激光扫描细胞仪(LSC)和流式细胞仪(FCM)，对一些肿瘤进行了DNA的测定，现介绍如下。
材料和方法
, 百拇医药
6例10%中性福尔马林固定，常规包埋的石蜡块，其中3例为重度不典型增生的大肠绒毛状腺瘤，1例高分化腺癌，2例中分化膀胱移行细胞癌。
光镜检查 HE切片，确定要进行DNA定量分析的部位，即肿瘤细胞最集中，间质相对少的区域。用搔刮器或类似物，如载玻片的锐角缘，轻轻刮石蜡块上相应部位，刮取少量粉末状组织，收集入小型玻璃管内。分别加入1 ml～2 ml二甲苯，充分摇匀，10 min后离心处理，弃上清液，再加入等量二甲苯，重复3次，然后在沉淀液中加入1 ml～2 ml 100%酒精，方法同前，重复3次，每次5～10 min。用注射器抽吸沉淀液，再用26 gauge的针头注入40 μm孔的尼龙网上过滤，过滤液入试管。
对于LSC，则取少量滤液滴于载玻片上，干燥后再滴上0.1 NHCl的0.5 %的胰蛋白酶，置于37℃的湿盒内1 h，用PBS冲洗后，滴入0.1 %核糖核酸酶和0.05 %碘化丙啶混合液20 min，用甲油封片，即可上机检测。用激光扫描仪(LSC101，Olympus)，一般10 min即可检查5000个细胞，10000个细胞以下已足以进行细胞分析。
, 百拇医药
对于FCM，即对试管内的过滤液依次用100 %、95 %、80 %、70 %、50 %酒精水化，每次5min，用蒸馏水洗后，加入0.1 N HCl的0.5 %胰蛋白酶消化，37℃水浴1 h，用PBS清洗后，取沉淀液。加入0.1 %核糖核酸和0.05 %碘化丙啶混合液，4℃避光静置20 min。然后上机检查，完成一个标本一般需要10～20 min。
以正常胸腺淋巴细胞悬浮液为对照组。每例操作过程在3～4 h内完成。
结果
1.LSC 激光扫描分析结果清楚地显示了各例的异倍体存在情况及其DNA指数(DI)，也显示了细胞周期中每阶段的细胞百分比，CV值相当低，均为3.0左右(见表1)。
表1 在LSC中6例肿瘤的S期细胞百分比和异倍体数及其DI值 病例
, 百拇医药 诊断
S期细胞百分比
各异倍体的DI值
CV
1
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
6.0
1.18 1.34 1.54 1.84
3.1
2
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
6.8
, http://www.100md.com
1.32 1.50 1.86
3.9
3
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
15.0
1.20 1.30 1.54 2.08
3.6
4
大肠高分化腺癌
11.5
1.20 1.32 1.42 1.70 2.04
2.7
, 百拇医药
5
膀胱中分化移行细胞癌
42.7
1.25 1.5
3.0
6
膀胱中分化移行细胞癌
43.9
1.41 1.72
3.0
在LSC中大肠癌前病变都被检出3～4组异倍体，而高分化腺癌有5组异倍体。中分化膀胱移行细胞癌也至少有2组异倍体，而且S期细胞百分比较高。
, http://www.100md.com
2.FCM：结果如表2所示。
表2 在FCM中6例肿瘤的异倍体的数量及其DI值、S期百分比和CV值 病例
诊 断
异倍体1
异倍体2
DI
S期细胞%
CV
DI
S期细胞%
CV
1
, http://www.100md.com
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
1.41
7.55
5.27
2
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
1.51
14.47
2.09
3
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
1.51
, http://www.100md.com
9.90
2.81
1.09
4.02
13.24
4
大肠高分化腺癌
1.50
13.99
2.76
1.76
0
3.95
, 百拇医药
5
膀胱中分化移行细胞癌
1.49
0
4.18
1.19
14.08
8.91
6
膀胱中分化移行细胞癌
1.50
13.53
2.56
, http://www.100md.com
FCM发现2例肿瘤和1例癌前病变中存在2组异倍体；癌组织中S期细胞的百分比都相对高，其CV值的变动范围较大，但绝大多数都在可信的范围内(除癌前病变的第2组异倍体外)。
讨论
本研究首次在国内报道了一种新的快速从石蜡块中分离细胞的方法和LSC技术。初步发现LSC和FCM之间的可比性，以及前者的优越性。在以单一细胞为对象的测定中，LSC和FCM无疑差别不大。但从组织中分离出的细胞不可能为单一的肿瘤细胞，在多种细胞成分状态下，LSC能把各群细胞识别出，明确癌细胞或要测定的细胞群。
为测得肿瘤细胞的真正的DNA的各项数值，首先设定DNA二倍体的标准是很重要的，本研究用胸腺淋巴细胞作对照。其次尽可能使测得者为欲测对象，从石蜡块中分离出的细胞中除有欲测的肿瘤细胞，还有其它细胞成分，包括破碎、不完整细胞，成纤维细胞，血管内皮细胞，增生的细胞，二联体，三联体等，这些成分的DNA的含量是不同的，常和肿瘤细胞的异倍体混在一起，LSC能把数值图中的细胞核点分开并了解每个分区中细胞的形态(见图1、2)，根据细胞形态，找到欲测细胞的分布区和它的DNA峰值，这样得出的数值应该说是更为精确[4]。
, http://www.100md.com
图1 为例1的FCM的DNA图，黑区是异倍体峰，DI为1.41
图2 同例的LSC的DNA图和相应分布区细胞图。A图为DNA曲线分析图 以DI值表示各峰，如(a)1.00，(f)2.00；B图为不同DI值的细胞分布图；C图为相应于A、B图中不同DI值区的系列细胞形态图。从图中可以看到a区是淋巴细胞(二倍体)；b,c,d,e区是不同异倍体的肿瘤细胞；f区为四倍体细胞。
目前国内开始用图象细胞仪(ICM)来检测肿瘤细胞的DNA[5]。ICM主要在组织切片上进行，比FCM简单易行。LSC被认为是结合了ICM和FCM的特长，而发展出的一项新的细胞分析技术[6]，在分析肿瘤的增生、DNA的含量中可信度高；它也能定量测定荧光免疫酶标，主要用于肿瘤基因改变上的判定。
, 百拇医药
在本研究中，看到大肠的癌前病变，即重度不典型增生的绒毛状腺瘤，及高分化腺癌和膀胱癌中都存在异倍体，多为多组异倍体。LSC和FCM都显示了各肿瘤的异倍体数及其DI值，在大肠中以癌中的异倍体数最多、DI值为最高。中分化膀胱癌细胞相对一致，形态异型不如大肠肿瘤明显，异常DNA峰少，但DI值还是较高的。FCM也显示了各肿瘤的异倍体，只在数值上与LSC略不同，其CV值相对高。LSC和FCM都显示了各肿瘤S期的细胞比例，从结果可以看到LSC的数值更详细、精确。
另外本研究证实了Kamada等提出的一种简单快速从石蜡包埋组织中分离细胞法是可行的，并对该法作了进一步改良，本研究表明其不但能用于LSC技术也可用于FCM。
正如许多学者指出的各种细胞分析技术都有一定局限性[7]，而LSC能否填补这方面的空缺，值得探讨。
致谢：日本界市立医院肿瘤研究科花井淳部长，松下典美技师提供的仪器设备条件和技术帮助。
, 百拇医药
作者简介：林梅绥，女，博士，主任医师。
参考文献
[1]Hedley DW, Friedlander ML, Taylor IW, et al. Method for analysis of cellular DNA content of paraffin-embedded pathological material using flow cytometry. J Histochem Cytochem, 1983,31:1333
[2]Kamentsky LA, Kamentsky LK. Microscope-based multipara-meter laser scanning cytometer yielding data comparable to flow cytometry data. Cytometry, 1991, 12:381
, http://www.100md.com
[3]Kamada T, Sasaki T, Tsuji T, et al. Sample preparation from paraffin-embedded tissue specimens for laser scanning cytometric DNA analysis. Cytometry, 1997, 27:290
[4]镰田朋美，古屋智子，小仓叶子. Laser scanning cytometry (LSC) の应用-细胞核DNAの测定. Cytometry Res, 1996, 6:21
[5]徐元鼎. 定量病理技术. 见：许良中主编. 实用肿瘤病理方法学. 上海医科大学出版社，1997：557
[6]Martin-Reay DG, Kamentsky L, Weinburg DS, et al. Evaluation of a new slide-based laser scanning cytometer for DNA analysis of tumor. Am J Clin Pathol, 1994, 102:432
[7]曹世龙. 人体实质性肿瘤的流式细胞分析术. 见：许良中主编. 实用肿瘤病理方法学. 上海医科大学出版社，1997：578
(收稿日期：1998-12-14 修回日期：1999-01-25), http://www.100md.com
单位：上海第二医科大学附属第九人民医院病理科(上海 200011)
关键词：
肿瘤990517 采用细胞分析技术对各种细胞，特别是肿瘤细胞的DNA测定，已开展20余年。最初是对血细胞、脱落细胞等分散的细胞进行分析，很快发展为从新鲜实质组织，以及石蜡包埋组织中分离细胞进行DNA测定[1]。由Kamentsky最近开发的新的细胞分析仪-激光扫描细胞仪(Laser Scanning Cytometer, LSC)[2]，以多组参数分析细胞及形态，成为国外的一个注目点。本研究用改良的方法，简单快速地从石蜡包埋组织中分离细胞[3]，同时用激光扫描细胞仪(LSC)和流式细胞仪(FCM)，对一些肿瘤进行了DNA的测定，现介绍如下。
材料和方法
, 百拇医药
6例10%中性福尔马林固定，常规包埋的石蜡块，其中3例为重度不典型增生的大肠绒毛状腺瘤，1例高分化腺癌，2例中分化膀胱移行细胞癌。
光镜检查 HE切片，确定要进行DNA定量分析的部位，即肿瘤细胞最集中，间质相对少的区域。用搔刮器或类似物，如载玻片的锐角缘，轻轻刮石蜡块上相应部位，刮取少量粉末状组织，收集入小型玻璃管内。分别加入1 ml～2 ml二甲苯，充分摇匀，10 min后离心处理，弃上清液，再加入等量二甲苯，重复3次，然后在沉淀液中加入1 ml～2 ml 100%酒精，方法同前，重复3次，每次5～10 min。用注射器抽吸沉淀液，再用26 gauge的针头注入40 μm孔的尼龙网上过滤，过滤液入试管。
对于LSC，则取少量滤液滴于载玻片上，干燥后再滴上0.1 NHCl的0.5 %的胰蛋白酶，置于37℃的湿盒内1 h，用PBS冲洗后，滴入0.1 %核糖核酸酶和0.05 %碘化丙啶混合液20 min，用甲油封片，即可上机检测。用激光扫描仪(LSC101，Olympus)，一般10 min即可检查5000个细胞，10000个细胞以下已足以进行细胞分析。
, 百拇医药
对于FCM，即对试管内的过滤液依次用100 %、95 %、80 %、70 %、50 %酒精水化，每次5min，用蒸馏水洗后，加入0.1 N HCl的0.5 %胰蛋白酶消化，37℃水浴1 h，用PBS清洗后，取沉淀液。加入0.1 %核糖核酸和0.05 %碘化丙啶混合液，4℃避光静置20 min。然后上机检查，完成一个标本一般需要10～20 min。
以正常胸腺淋巴细胞悬浮液为对照组。每例操作过程在3～4 h内完成。
结果
1.LSC 激光扫描分析结果清楚地显示了各例的异倍体存在情况及其DNA指数(DI)，也显示了细胞周期中每阶段的细胞百分比，CV值相当低，均为3.0左右(见表1)。
表1 在LSC中6例肿瘤的S期细胞百分比和异倍体数及其DI值 病例
, 百拇医药 诊断
S期细胞百分比
各异倍体的DI值
CV
1
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
6.0
1.18 1.34 1.54 1.84
3.1
2
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
6.8
, http://www.100md.com
1.32 1.50 1.86
3.9
3
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
15.0
1.20 1.30 1.54 2.08
3.6
4
大肠高分化腺癌
11.5
1.20 1.32 1.42 1.70 2.04
2.7
, 百拇医药
5
膀胱中分化移行细胞癌
42.7
1.25 1.5
3.0
6
膀胱中分化移行细胞癌
43.9
1.41 1.72
3.0
在LSC中大肠癌前病变都被检出3～4组异倍体，而高分化腺癌有5组异倍体。中分化膀胱移行细胞癌也至少有2组异倍体，而且S期细胞百分比较高。
, http://www.100md.com
2.FCM：结果如表2所示。
表2 在FCM中6例肿瘤的异倍体的数量及其DI值、S期百分比和CV值 病例
诊 断
异倍体1
异倍体2
DI
S期细胞%
CV
DI
S期细胞%
CV
1
, http://www.100md.com
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
1.41
7.55
5.27
2
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
1.51
14.47
2.09
3
大肠绒毛状腺瘤伴重度不典型增生
1.51
, http://www.100md.com
9.90
2.81
1.09
4.02
13.24
4
大肠高分化腺癌
1.50
13.99
2.76
1.76
0
3.95
, 百拇医药
5
膀胱中分化移行细胞癌
1.49
0
4.18
1.19
14.08
8.91
6
膀胱中分化移行细胞癌
1.50
13.53
2.56
, http://www.100md.com
FCM发现2例肿瘤和1例癌前病变中存在2组异倍体；癌组织中S期细胞的百分比都相对高，其CV值的变动范围较大，但绝大多数都在可信的范围内(除癌前病变的第2组异倍体外)。
讨论
本研究首次在国内报道了一种新的快速从石蜡块中分离细胞的方法和LSC技术。初步发现LSC和FCM之间的可比性，以及前者的优越性。在以单一细胞为对象的测定中，LSC和FCM无疑差别不大。但从组织中分离出的细胞不可能为单一的肿瘤细胞，在多种细胞成分状态下，LSC能把各群细胞识别出，明确癌细胞或要测定的细胞群。
为测得肿瘤细胞的真正的DNA的各项数值，首先设定DNA二倍体的标准是很重要的，本研究用胸腺淋巴细胞作对照。其次尽可能使测得者为欲测对象，从石蜡块中分离出的细胞中除有欲测的肿瘤细胞，还有其它细胞成分，包括破碎、不完整细胞，成纤维细胞，血管内皮细胞，增生的细胞，二联体，三联体等，这些成分的DNA的含量是不同的，常和肿瘤细胞的异倍体混在一起，LSC能把数值图中的细胞核点分开并了解每个分区中细胞的形态(见图1、2)，根据细胞形态，找到欲测细胞的分布区和它的DNA峰值，这样得出的数值应该说是更为精确[4]。
, http://www.100md.com
图1 为例1的FCM的DNA图，黑区是异倍体峰，DI为1.41
图2 同例的LSC的DNA图和相应分布区细胞图。A图为DNA曲线分析图 以DI值表示各峰，如(a)1.00，(f)2.00；B图为不同DI值的细胞分布图；C图为相应于A、B图中不同DI值区的系列细胞形态图。从图中可以看到a区是淋巴细胞(二倍体)；b,c,d,e区是不同异倍体的肿瘤细胞；f区为四倍体细胞。
目前国内开始用图象细胞仪(ICM)来检测肿瘤细胞的DNA[5]。ICM主要在组织切片上进行，比FCM简单易行。LSC被认为是结合了ICM和FCM的特长，而发展出的一项新的细胞分析技术[6]，在分析肿瘤的增生、DNA的含量中可信度高；它也能定量测定荧光免疫酶标，主要用于肿瘤基因改变上的判定。
, 百拇医药
在本研究中，看到大肠的癌前病变，即重度不典型增生的绒毛状腺瘤，及高分化腺癌和膀胱癌中都存在异倍体，多为多组异倍体。LSC和FCM都显示了各肿瘤的异倍体数及其DI值，在大肠中以癌中的异倍体数最多、DI值为最高。中分化膀胱癌细胞相对一致，形态异型不如大肠肿瘤明显，异常DNA峰少，但DI值还是较高的。FCM也显示了各肿瘤的异倍体，只在数值上与LSC略不同，其CV值相对高。LSC和FCM都显示了各肿瘤S期的细胞比例，从结果可以看到LSC的数值更详细、精确。
另外本研究证实了Kamada等提出的一种简单快速从石蜡包埋组织中分离细胞法是可行的，并对该法作了进一步改良，本研究表明其不但能用于LSC技术也可用于FCM。
正如许多学者指出的各种细胞分析技术都有一定局限性[7]，而LSC能否填补这方面的空缺，值得探讨。
致谢：日本界市立医院肿瘤研究科花井淳部长，松下典美技师提供的仪器设备条件和技术帮助。
, 百拇医药
作者简介：林梅绥，女，博士，主任医师。
参考文献
[1]Hedley DW, Friedlander ML, Taylor IW, et al. Method for analysis of cellular DNA content of paraffin-embedded pathological material using flow cytometry. J Histochem Cytochem, 1983,31:1333
[2]Kamentsky LA, Kamentsky LK. Microscope-based multipara-meter laser scanning cytometer yielding data comparable to flow cytometry data. Cytometry, 1991, 12:381
, http://www.100md.com
[3]Kamada T, Sasaki T, Tsuji T, et al. Sample preparation from paraffin-embedded tissue specimens for laser scanning cytometric DNA analysis. Cytometry, 1997, 27:290
[4]镰田朋美，古屋智子，小仓叶子. Laser scanning cytometry (LSC) の应用-细胞核DNAの测定. Cytometry Res, 1996, 6:21
[5]徐元鼎. 定量病理技术. 见：许良中主编. 实用肿瘤病理方法学. 上海医科大学出版社，1997：557
[6]Martin-Reay DG, Kamentsky L, Weinburg DS, et al. Evaluation of a new slide-based laser scanning cytometer for DNA analysis of tumor. Am J Clin Pathol, 1994, 102:432
[7]曹世龙. 人体实质性肿瘤的流式细胞分析术. 见：许良中主编. 实用肿瘤病理方法学. 上海医科大学出版社，1997：578
(收稿日期：1998-12-14 修回日期：1999-01-25), http://www.100md.com